تکنیک فلوسایتومتری | چیستی، استفاده، فرآیند و ضرورت‌ها

 امروزه تکنیک فلوسایتومتری به طور گسترده در زمینه‌هایی مانند ایمونولوژی، هماتولوژی، انکولوژی و میکروبیولوژی استفاده می‌شود و به یک ابزار ضروری برای محققان و پزشکان تبدیل شده است. تکنیک فلوسایتومتری می‌تواند پارامترهای متعدد هزاران سلول یا ذره را تنها در چند ثانیه با استفاده از لیزر و آشکارساز اندازه‌گیری کند. این روش به محققان اجازه می‌دهد تا به سرعت انواع سلول‌های خاص را شناسایی و تجزیه‌وتحلیل کنند، تغییرات جمعیت سلولی را در طول زمان بررسی کنند و رفتار سلول‌ها را در شرایط مختلف مطالعه کنند. در ادامه با مجله بیوزوم همراه باشید تا بیشتر با این تکنیک ارزشمند آشنا شوید.

تکنیک فلوسایتومتری چیست؟

تکنیک فلوسایتومتری (Flow Cytometry) از دو بخش Flow (جریان) و Cytometry (اندازه‌گیری سلولی) تشکیل شده است. فلوسایتومتری یک تست آزمایشگاهی است که برای تجزیه‌وتحلیل ویژگی‌های سلول‌ها یا ذرات استفاده می‌شود.  به وسیله‌ی این تکنیک می‌توان روی انواع سلول‌های جانوری و انسان، رده‌های سلولی و سلول‌های گیاهی، باکتری‌ها و کروموزوم‌ها و اجزای سلولی (اندامک) بررسی انجام داد.

ساختار دستگاه فلوسایتومتری ۳ بخش کلی دارد:

• سیستم سیال (Fluidics)
• سیستم نوری (Optics)
• سیستم الکترونیکی (Electronics)

سیستم سیال

بخشی است که ذرات را به‌صورت جریان مایعی از ذرات درمی‌آورد و آن‌ها را یک‌به‌یک از مقابل نور لیزر جلو می‌برد.

سیستم نوری

مرکب از منابع لیزر، آینه‌ها، فیلترهای نوری، (Detector) که درواقع سیگنال نوری از منبع تولید می‌شود از این موارد رد می‌شود و به سمت آشکارسازها هدایت می‌شود.

سیستم الکترونیکی

سیگنال نوری که دریافت شده را به سیگنال الکتریکی تبدیل می‌کند و بعد از اینکه آن را تقویت و دیجیتالی می‌کند که قابل‌ارزیابی باشد آن را جهت پردازش به کامپیوتر می‌فرستد.

به طور کلی در تکنیک فلوسایتومتری، سلول‌ها به‌صورت یک مخلوط در یک‌فاز معلق (سوسپانسیون) قرار می‌گیرند و در جریانی در طی مدت زمانی کوتاه این سلول‌ها تک‌به‌تک از مقابل نور لیزر عبور می‌کنند و با این عبور تک‌تک ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی سلول‌ها یا ذرات مورد‌نظر بررسی می‌شود. تقریباً ۱۰۰۰۰ سلول را می‌توان در کمتر از یک دقیقه توسط رایانه تجزیه‌وتحلیل و پردازش کرد.

تکنیک فلوسایتومتری برای چه مواردی استفاده می‌شود؟

به طور خاص، کاربرد فلوسایتومتری در تحقیقات برای اهداف مختلفی تعریف شده است، از جمله اهداف می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

شمارش سلول

کاربرد فلوسایتومتری در شمارش سلولی یکی از مهم‌ترین موارد استفاده از آن است. فلوسایتومتری می‌تواند ذرات معلق در سوسپانسیون را بشمرد. با این شمردن تعداد سلول‌های زنده و مرده را هم مشخص می‌کند و در واقع سلول‌های زنده را از مرده تفکیک می‌کند.

مرتب سازی سلولی

مرتب‌سازی سلولی توسط فلوسایتومتری که به‌عنوان مرتب‌سازی سلول فعال شده با فلورسانس (FACS) نیز شناخته می‌شود، تکنیکی است که برای جداسازی فیزیکی سلول‌ها بر اساس نتایج آنالیز فلوسایتومتری استفاده می‌شود. این فرایند امکان جداسازی زیر جمعیت‌‌های سلولی خاص از مخلوط‌های سلولی پیچیده را فراهم می‌کند و محققان را قادر می‌سازد سلول‌های رویدادی نادر و داده‌های فنوتیپی بسیار پیچیده را مطالعه کنند.

تعیین عملکرد سلول

تعیین عملکرد سلول توسط تکنیک فلوسایتومتری شامل استفاده از این فناوری برای ارزیابی جنبه‌های مختلف رفتار و ویژگی‌های سلولی است. تکنیک فلوسایتومتری می‌تواند تعیین کند که هر سلولی که در مجموعه سلولی است در چه سیکل سلولی است، چقدر بقا و چند درصد مردند، چند درصد در فاز تکثیر هستند و هر کدام چه مارکری را بیان می‌کنند. فعالیت آنزیمی و تغییرات pH، متابولیسم‌های اکسیداتیو و سایر فعالیت‌های سلولی نیز توسط فلوسایتومتری مشخص می‌شود.

تعیین خصوصیات سلولی

تکنیک فلوسایتومتری می‌تواند ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی سلول‌ها یا ذرات، از جمله اندازه سلول، پیچیدگی سیتوپلاسمی، محتوای DNA یا RNA و طیف وسیعی از پروتئین‌های متصل به غشا و درون‌سلولی را اندازه‌گیری کند.

شناسایی میکروارگانیسم‌ها مانند باکتری، قارچ یا مخمر

تکنیک فلوسایتومتری می‌تواند برای شناسایی میکروارگانیسم‌هایی مانند باکتری‌ها، قارچ‌ها یا مخمرها با استفاده از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی دوگانه با رنگ‌های فلورسنت مختلف استفاده شود. این رویکرد امکان تمایز میکروارگانیسم‌ها را بر اساس الگوهای فلورسنت منحصربه‌فرد آنها فراهم می‌کند که با استفاده از تجزیه‌وتحلیل دوبعدی کمی‌سازی می‌شوند.

یافتن نشانگرهای زیستی (خصوصیاتی که عملکرد طبیعی را نشان می‌دهد)

 تکنیک فلوسایتومتری یک ابزار همه‌کاره و قدرتمند برای تحقیقات نشانگرهای زیستی است، زیرا به دلیل ماهیت چند پارامتر خود می‌تواند اطلاعات بسیار دقیقی را در مورد سلول‌های فردی در یک جمعیت ناهمگن ارائه دهد. فلوسایتومتری در هر دو محیط بالینی و بالینی برای تولید داده‌های نشانگر زیستی استفاده می‌شود که می‌تواند تصمیم‌گیری در مورد انتخاب دوز در آزمایش‌های بالینی، گزینه‌های درمانی برای بیماران سرطانی و حتی مناسب بودن بیماران برای پیوند را تعیین کند.

تشخیص و درمان بالقوه سرطان خون و مغز استخوان

تکنیک فلوسایتومتری نقش مهمی در تشخیص و درمان بالقوه سرطان خون و مغز استخوان دارد. این فناوری برای شناسایی و تجزیه‌وتحلیل ویژگی‌های شیمیایی و فیزیکی سلول‌ها استفاده می‌شود و آن را به ابزاری ارزشمند در ارزیابی مغز استخوان، خون محیطی و سایر مایعات بدن برای ناهنجاری‌های مرتبط با سرطان تبدیل می‌کند. در زمینه سرطان‌های خون و مغز استخوان، تکنیک فلوسایتومتری برای توصیف و شمارش انواع گلبول‌های سفید خون استفاده می‌شود که به ارزیابی بیماری‌های عفونی، اختلالات خودایمنی یا نقص ایمنی کمک می‌کند. همچنین در تشخیص و طبقه‌بندی انواع خاصی از سرطان‌ها مانند لوسمی یا لنفوم مفید است.

چه زمانی آزمایش فلوسایتومتری ضروری است؟

تکنیک فلوسایتومتری ممکن است برای مشخص‌کردن و شمارش انواع گلبول‌های سفید خون در ارزیابی بیماری‌های عفونی، اختلالات خودایمنی یا نقص ایمنی استفاده شود. همچنین برای تشخیص و طبقه‌بندی لوسمی یا لنفوم استفاده می‌شود. فلوسایتومتری معمولاً به‌عنوان آزمایش بعدی پس از شمارش کامل خون (CBC) یا اسکن گلبول‌های سفید (WBC) استفاده می‌شود. این امر به‌ویژه در صورتی صادق است که آزمایش اولیه افزایش تعداد لنفوسیت‌ها، تعداد سلول‌های غیرطبیعی یا وجود سلول‌های خونی نابالغ را نشان دهد. ارائه‌دهنده‌های مراقبت‌های بهداشتی از فلوسایتومتری برای پیش‌بینی میزان تهاجمی بودن سرطان و کمک به تعیین این‌که آیا سرطان به درمان خاصی پاسخ می‌دهد یا خیر، استفاده می‌کنند. همچنین می‌تواند به شما بگوید که آیا بیماری پس از درمان عود کرده است یا خیر.

تکنیک فلوسایتومتری ممکن است هر زمان که ارائه‌دهنده مراقبت‌های بهداشتی نیاز به کسب اطلاعات بیشتر در مورد سلول‌های داخل بدن شما داشته باشد استفاده شود. این نوع آزمایش می‌تواند تعداد سلول‌های ایمنی را بررسی کند، مراحل چرخه سلولی را تعیین کند، سلول‌های سرطانی را شناسایی کند یا حتی DNA را تجزیه‌وتحلیل کند. محققان هر زمان که بخواهند درباره پیچیدگی‌های برخی شرایط و بیماری‌ها بیشتر بدانند، از فلوسایتومتری استفاده می‌کنند.

فرایند تکنیک فلوسایتومتری

 در تکنیک فلوسایتومتری برای تجزیه‌وتحلیل سلول‌ها از عبور پرتوهای لیزر و جمع‌آوری نور ساطع شده یا پراکنده استفاده می‌شود. این فرایند شامل سوسپانسیونی از سلول‌ها یا ذرات در مایع (ایزوتونیک) و تزریق آن به دستگاه فلوسیتومتر است. سپس دستگاه سلول‌ها را در یک خط مرتب می‌کند و آن‌ها را از مقابل یک پرتو لیزر عبور می‌دهد، جایی که نور پراکنده و نور فلورسنت جمع‌آوری شده و برای شمارش و طبقه‌بندی سلول‌ها استفاده می‌شود.

فرایند فلوسایتومتری متکی بر تمرکز هیدرودینامیکی نمونه سوسپانسیون سلولی برای ایجاد یک جریان تک‌سلولی است که از مقابل لیزر عبور می‌کند. سپس داده‌های آنالوگ تولید شده از تعامل سلول با لیزر به داده‌های دیجیتالی تبدیل می‌شوند که می‌توانند کمی‌سازی و رسم شوند.

 به‌عنوان مثال یک آنتی‌بادی خاص که برای پروتئین سطح سلولی خاص با یک مولکول فلورسنت همراه است به مخلوطی از سلول‌ها اضافه می‌شود، در حالی که سلول‌های خاصی از پرتو لیزر عبور می‌کنند و تحت نظارت قرار می‌گیرند، بر اساس این‌که سلول دارای آنتی‌بادی با برچسب فلورسنت است یا خیر، به قطرات حاوی یک سلول منفرد، بار مثبت یا منفی نسبت داده می‌شود. قطرات حاوی یک سلول منفرد سپس توسط یک میدان الکتریکی شناسایی شده و با توجه ‌به بار خود به لوله‌های جمع‌آوری جداگانه هدایت می‌شوند که امکان جداسازی آسان سلول‌های مشخص شده با آنتی‌بادی فلورسنت را فراهم می‌کند.

فرایند فلوسایتومتری جمعیت‌های خاصی از سلول‌ها و زیرمجموعه‌های درون این سلول‌ها را  از طریق مرتب‌سازی سلولی (FACS) تعریف و به‌صورت فیزیکی جدا می‌کند. مرتب‌سازی سلولی (FACS) به این صورت است که فرایند فلوسایتومتری ذرات یا سلول‌ها را می‌تواند بر اساس خصوصیات مولکولی مارکرهای سطحی شناسایی و بررسی، و حتی آن‌ها را از هم تفکیک کند و در انتها هر کدام از آن‌ها را در یک لوله به ما تحویل دهد و ما هر کدام از آن‌ها را برداشته و روی آن آزمایش انجام دهیم.

فلوسایتومتری چندرنگ

تکنیک فلوسایتومتری چندرنگی یک تکنیک مفید برای بررسی جمعیت‌های ترکیبی از سلول‌ها، مانند سلول‌های خون و بافت در نمونه‌های انسانی و حیوانی است. به طور کلی، یک نوع سلول خاص با رنگ فلورسنت (نشانگرها) مانند فلوروفور (Fluorophore) یا پروپیدیوم یدید (Propidium iodide) مشخص می‌شود. توانایی استفاده از چندین نشانگر فلورسنت به طور هم‌زمان امکان شناسایی انواع سلول‌های متعدد و همچنین نشانگرهای عملکردی را فراهم می‌کند که دقت تشخیص سلول و یا مارکر خاص را در نمونه موردنظر بیشتر می‌کند. ابزارهای تخصصی با قابلیت اندازه‌گیری ۱۲ رنگ وجود دارد. این رنگ‌ها و نشانگرهای فلورسنت با طول‌موج‌های مختلف نور ساطع شده از لیزر اندازه‌گیری می‌شوند تا بر اساس نوع سلول جداگانه مرتب شوند. هر نشانگر در طول‌موج خاصی از نور برانگیخته می‌شود تا هنگام استفاده از چندین نشانگر، آن‌ها را متمایز کند.

نتایج جستجوی اطلاعاتی در مورد فلوسایتومتری، به‌ویژه فلوسایتومتری چندرنگ، و طراحی پنل‌های این تکنیک اهمیت درک قابلیت‌های فلوسایتومتر، از جمله تعداد لیزرها و آشکارسازها و پیکربندی فیلترها را برجسته می‌کند. کالیبراسیون منظم و جابه‌جایی ملایم سلول‌ها نیز مورد تأکید است. نتایج همچنین چالش‌های اتصال غیراختصاصی آنتی‌بادی‌ها، استفاده از کنترل‌های ایزوتیپ و اهمیت انتخاب فلوروفورهای مناسب را مورد بحث قرار می‌دهند.

 همچنین در رابطه با تکنیک فلوسایتومتری چندرنگ، نتایج جستجو از این بیانیه پشتیبانی می‌کند که تطبیق یک صفحه رنگ‌آمیزی  (Panel) معمولی از ۴ تا ۶ رنگ به بیش از ۱۲ رنگ صرفاً یک “وصل و بازی” نیست. پیچیدگی طراحی پنل فلوسایتومتری، از جمله نیاز به درنظرگرفتن قابلیت‌های فلوسایتومتر، ویژگی آنتی‌بادی‌ها و پتانسیل اتصال غیراختصاصی، نشان می‌دهد که بهینه‌سازی دقیق برای انتقال از ۴ به ۱۲ رنگ مورد نیاز است. نتایج جستجو پنل رنگی همچنین اهمیت درک طیف‌های تحریک و انتشار فلوروفورها بین کانال‌های تشخیص را نشان می‌دهد، که طراحی پنل‌های پر رنگ را پیچیده‌تر می‌کند.

کاربردهای متداول روش فلوسایتومتری

تکنیک فلوسایتومتری یک جزء جدایی‌ناپذیر در چندین حوزه بالینی از جمله تشخیص، طرح‌های درمانی و بیماری‌های سیستمیک و استاتیک  (Systemic and Static) یا پیش‌رونده است. اکنون، بیش از هر زمان دیگری، محققان بسیار هیجان‌زده هستند که بتوانند درباره پیچیدگی‌های برخی بیماری‌ها و شرایط بیشتر بیاموزند. این امر منجر به تغییر سریع در تشخیص رویکردهای پزشکی (تجزیه‌وتحلیل داده‌های چند متغیری و تکنیک تشخیص الگو) برای درمان بیماری‌هایی مانند سرطان شده است.

روش فلوسایتومتری اغلب با سایر الگوهای آزمایش جامع مانند بررسی مورفولوژیک درگیر است. در بسیاری از موارد، نئوپلاسم‌های هماتولوژیک تغییرات مورفولوژیکی خاصی را نشان می‌دهند و فلوسایتومتری ویژگی بیشتری را ارائه می‌دهد و به آسیب‌شناسان کمک می‌کند تا ناهنجاری‌های بافتی یا سایر بیماری‌های پیشرفته را شناسایی کنند. تکنیک فلوسایتومتری، در برخی موارد، می‌تواند عود سرطان را قبل از تشخیص تغییرات مورفولوژیکی تعیین کند.

چند مورد از کاربردهای عمده مورد استفاده در حوزه محیط‌های بالینی مدرن، هم درمانی و هم پژوهش‌محور عبارت‌اند از:

• بیان پروتئین – در سراسر سلول، حتی هسته
• اصلاحات پس از ترجمه پروتئین – شامل پروتئین‌های شکافته شده و فسفریله شده است
• RNA- شامل رونوشت‌های miRNA و mRNA
• وضعیت سلامت سلول – تشخیص سلول‌های آپوپتوز یا مرگ سلولی
• وضعیت چرخه سلولی – ارائه یک ابزار قدرتمند برای ارزیابی سلول‌ها در فاز G0/G1 در مقابل فاز S، G2 یا پلی‌پلوئیدی، از جمله تجزیه‌وتحلیل تکثیر و فعال‌سازی سلولی
• شناسایی و مشخصه‌یابی زیرمجموعه‌های متمایز از سلول‌ها در یک نمونه ناهمگن – از جمله تشخیص سلول‌های عامل حافظه مرکزی از سلول‌های T خسته یا سلول‌های T تنظیمی

اصول اساسی تکنیک فلوسایتومتری در دهه گذشته تغییر چندانی نکرده است، اما کاربردهای این فناوری بسیار تکامل‌یافته است. پایه‌های فلوسایتومتری با عملکرد اصلی آن، یعنی بررسی سلول‌ها یا ذرات منفرد در یک جریان با لیزر، زمانی که سلول‌ها از کنار مجموعه‌ای از آشکارسازهای ثابت حرکت می‌کنند، سازگار است. به طور فزاینده‌ای، رنگ‌های بیشتری از فلورسانس توسط سیتومترها (Cytometry) در کنار مرتب‌سازی با سرعت بالا و عملکرد تحلیلی شناسایی می‌شوند. سیتومتر (Cytometry) است که سلول‌ها را با عبوردادن یک‌به‌یک از پرتو لیزر شمارش و تجزیه‌وتحلیل می‌کند. این یکی از اجزای ضروری تکنیک فلوسایتومتری است که مسئول اندازه‌گیری پارامترهای نوری مختلف روی سلول‌های منفرد در یک جریان سیال است. سیتومتر به کامپیوتری متصل است که داده‌های به‌دست‌آمده از سلول‌های عبوری را پردازش می‌کند. این فرایند امکان جداسازی، شمارش، تشخیص بیومارکرها و مهندسی پروتئین را با تجزیه‌وتحلیل سلول‌ها بر اساس خواص نوری آن‌ها فراهم می‌کند. سیتومتر نقش مهمی در تجزیه‌وتحلیل دقیق و با سرعت بالا سلول‌ها در فلوسایتومتری ایفا می‌کند و امکان شناسایی و تشخیص جمعیت‌های مختلف سلولی را برای اهداف مختلف تحقیقاتی و تشخیصی فراهم می‌کند.

تکنیک فلوسایتومتری نقش مهمی در تحقیقات علم مولکولی ایفا می‌کند و با سرعت به تکامل خود ادامه می‌دهد. فلوسایتومترهای تجاری متعددی در بازار وجود دارد. بازار شاهد افزایش‌پذیرش فلوسایتومتری در بخش‌های مختلف، از جمله شرکت‌های داروسازی برای فرایندهای کشف و توسعه دارو، تشخیص بالینی بیماری‌هایی مانند ایدز (HIV/AIDS) و لوسمی، و تحقیقات ایمونوتراپی است.  در طراحی فلوسایتومترهای تجاری تمایل بر این است که بر اساس یک اصل کار کنند، اما تفاوت‌های مهمی در طراحی آن‌ها و مفاهیم مربوط به تراز و ادغام سایر اجزا وجود دارد.

به‌زودی در افق، یک ابزار دقیق سه‌بعدی معرفی و در یک ابزار ترکیبی اختصاصی تولید شده توسط NanoCellect Biomedical، WOLF Cell Sorter، وارد می‌شود. همچنین می‌توانیم منتظر توسعه پروب‌های فلورسنت با طیف باریک، ادغام تکنولوژی آنالیز فلوسایتومتری و فناوری ارزیابی سلولی باشیم.

آنالیز داده‌های فلوسایتومتری

تجزیه‌وتحلیل داده‌های فلوسایتومتری شامل تفسیر نتایج به‌دست‌آمده از فلوسایتومتر است، فرایند تجزیه‌وتحلیل معمولاً شامل چندین مرحله از جمله نصب و تنظیم الکترونیک، جمع‌آوری داده‌ها و تفسیر نتایج است.

راه‌اندازی یا نصب (setting up) لوازم الکترونیکی شامل تعیین پارامترها برای اطمینان از پوشاندن ناحیه مناسب برای مشاهده مجموعه کامل نور پراکنده است که به آشکارسازها برخورد می‌کند. تنظیم الکترونیکی برای اندازه‌گیری دقیق نوری که در جهات مختلف پراکنده می‌شود مهم است، که می‌تواند اطلاعاتی در مورد اندازه و دانه‌بندی (Granularity) یا پیچیدگی داخلی سلول‌ها ارائه دهد.

جمع‌آوری داده‌ها شامل جمع‌آوری و تجزیه‌وتحلیل داده‌های تولید شده توسط فلوسایتومتر است. این می‌تواند شامل استفاده از استراتژی‌های گیتینگ (Gating) برای شناسایی جمعیت سلول‌ها با ویژگی‌های مشترک بر اساس پراکندگی روبه‌جلو (FSC)، پراکندگی جانبی (SSC) و بیان نشانگر باشد. گیتینگ (Gating) شامل قراردادن مناطقی در اطراف جمعیت‌های سلولی با ویژگی‌های مشترک برای بررسی و تعیین کمیت این جمعیت‌های موردنظر است. این را می‌توان با استفاده از هیستوگرام‌ها، نمودار چگالی و نقطه‌ای و نمودار‌های کانتور انجام داد، که می‌تواند به تجسم داده‌ها و شناسایی الگوها یا روندها کمک کند.

نمودار هیستوگرام فلوسایتومتری

هیستوگرام‌های تک پارامتری اندازه‌گیری واحد یک پارامتر (فلورسانس نسبی یا شدت پراکندگی نور) را در محور x و تعداد رویدادها (تعداد سلول‌ها) را در محور y نمایش می‌دهند.

هیستوگرام تعداد کل سلول‌های نمونه را نشان می‌دهد که دارای ویژگی‌های فیزیکی خاصی هستند که برای آن انتخاب شده‌اند یا نشانگر موردنظر را بیان می‌کنند. سلول‌هایی با ویژگی‌های موردنظر به‌عنوان مجموعه‌داده مثبت شناخته می‌شوند. در حالت ایده‌آل، فلوسایتومتری یک پیک مجزا تولید می‌کند که می‌تواند به‌عنوان مجموعه‌داده مثبت تفسیر شود. بااین‌حال، در بسیاری از موقعیت‌ها، تجزیه‌وتحلیل جریان بر روی یک جمعیت مختلط از سلول‌ها انجام می‌شود که منجر به چندین پیک در هیستوگرام می‌شود. به‌منظور شناسایی مجموعه‌داده مثبت، فلوسایتومتری باید در حضور یک کنترل ایزوتایپ (Isotype) منفی مناسب تکرار شود.

     هیستوگرام‌های دو پارامتری اندازه‌گیری دو پارامتر را نشان می‌دهند، یکی در محور x و دیگری در محور y، و تعداد سلول‌ها به‌عنوان نمودار چگالی (نقطه) یا نقشه کانتور است. پارامترها می‌توانند   (Side Scatter) SSC ، FSC (Forward Scatter) یا فلورسانس باشند.

نمودار چگالی فلوسایتومتری

 همان‌طور که قبلاً توضیح داده شد، یک اصل مهم در تجزیه‌وتحلیل داده‌های فلوسایتومتری، تجسم انتخابی سلول‌های موردنظر در عین حذف نتایج حاصل از ذرات ناخواسته است به‌عنوان مثال سلول‌های مرده و باقی‌مانده، به این روش گیتینگ (Gating) می‌گویند.

در نمودار چگالی، هر نقطه نشان‌دهنده یک سلول یا ذره واحد است که از فلوسایتومتر عبور کرده است. تجزیه‌وتحلیل سلول‌های خون کامل لیز شده رایج‌ترین کاربرد گیتینگ است و نمودارهای معمولی را برای SSC در مقابل FSC  هنگام استفاده از تعداد بالای سلول‌ها نشان می‌دهد. به طور معمول، سیگنال FSC (شدت نور FSC) ارتباط نزدیکی با اندازه سلول منفرد دارد. این بدان معناست که برای همان نوع سلول، سلول‌هایی با مناطق بزرگ‌تر سیگنال‌های FSC قوی‌تری را به وجود می‌آورند. سنجش SSC بر اساس خواص اندامک‌ها و ذرات درون‌سلولی مرتب می‌شود. اگرچه تحت‌تأثیر شکل و اندازه سلول‌ها قرار می‌گیرد، اما نسبت به غشاها، سیتوپلاسم، هسته و غیره حساس‌تر است.

بنابراین، چگالی نقاط در یک ناحیه معین از نمودار نشان‌دهنده تعداد سلول‌ها یا ذرات با همان مقدار پارامتر اندازه‌گیری شده است. نمودار می‌تواند برای شناسایی جمعیت سلول‌ها یا ذرات با ویژگی‌های خاص بر اساس پارامتر اندازه‌گیری شده استفاده شود.

نمودار کانتور فلوسایتومتری

نمودارهای کانتور یک روش جایگزین برای نشان‌دادن همان داده‌هایی است که نمودار چگالی انجام می‌دهد. خطوط به‌هم‌پیوسته تعداد مشابهی از سلول‌ها را نشان می‌دهند. این نمودار ظاهر یک نقشه برآورد جغرافیایی را به خود می‌گیرد که در اصل، شباهت زیادی به نمودار چگالی دارد. این یک موضوع ترجیحی است، اما گاهی اوقات جمعیت‌های گسسته سلول‌ها در نمودارهای کانتور راحت‌تر قابل‌مشاهده است.

نقشه‌های کانتور فلوسایتومتری راهی برای تجسم داده‌های فلوسایتومتری با استفاده از خطوط کانتور برای نشان‌دادن فراوانی یا فرکانس نسبی داده‌ها است. خطوط کانتور برای محصور کردن درصد مساوی از رویدادها استفاده می‌شوند و خطوط کانتوری که نزدیک به هم هستند، غلظت بالایی از رویدادها را نشان می‌دهند. نمودارهای کانتور برای مشاهده خوشه‌بندی حول محورها مفید هستند و می‌توانند مؤثرتر از نمودارهای نقطه‌ای برای تعداد رویدادهای بالا باشند؛ زیرا فراوانی نسبی رویدادها را با جزئیات بیشتری نشان می‌دهند. نمودارهای کانتور همچنین می‌توانند برای مشاهده تجمع رویدادها در امتداد محورها مفید باشند، جایی که نمودارهای نقطه یا تراکم ممکن است جزئیات قابل‌تشخیص را ارائه ندهند.

آنالیز محاسباتی فلوسایتومتری

تفسیر نتایج شامل تجزیه‌وتحلیل داده‌ها برای استخراج اطلاعات موردنظر از نمونه است. این آنالیز می‌تواند شامل استفاده از نرم‌افزار تحلیلی برای اندازه‌گیری پارامترهای مختلف، مانند میانگین شدت فلورسانس (MFI) باشد، که می‌تواند اطلاعاتی در مورد روشنایی و فراوانی نشانگرهای خاص ارائه دهد.

همچنین می‌تواند شامل استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیک برای شناسایی و تجزیه‌وتحلیل گروه‌های فرعی سلول‌ها بر اساس ویژگی‌های آن‌ها باشد. فلوسایتومتری محاسباتی یک زمینه روبه‌رشد است که ایمونولوژی و زیست‌شناسی محاسباتی را برای تجزیه‌وتحلیل و تجسم داده‌های فلوسایتومتری با ابعاد بالا ترکیب می‌کند.

پیشرفت‌های اخیر در سیتومتری منجر به توسعه ابزارهای محاسباتی جدید برای تجزیه‌وتحلیل و تجسم داده‌ها شده است. فلوسایتومتری محاسباتی شامل مراحل مختلفی از جمله پیش‌پردازش، تجسم و شناسایی جمعیت سلولی است. پیش‌پردازش شامل دست‌کاری داده‌ها (Manipulation)، گیتینگ (Gating)، جبران (Compensation) و تبدیل (Transformation) است. تکنیک‌های تجسم شامل کاهش ابعاد و تجسم با استفاده از روش‌های t-SNE، UMAP و دیگر روش‌ها است.

شناسایی جمعیت سلولی شامل استفاده از الگوریتم‌هایی مانند flowClust، flowEMMI، flowPeaks و FlowSOM است. تکنیک‌های انگشت‌نگاری سیتومتری شامل CHIC، flowCyBar، flowDiv، flowFP، Phenoflow و PhenoGMM، می‌باشد. ذخیره‌سازی داده‌ها توسط پایگاه‌های داده عمومی مانند FlowRepository تسهیل می‌شود.

جمع‌بندی

مجله بیوزوم امیدوار است با ارائه‌ی این مطلب شما را بیشتر با فلوسایتومتری آشنا کرده باشد. فلوسایتومتری یک ابزار قدرتمند با کاربرد در ایمونولوژی، زیست‌شناسی مولکولی، باکتری‌شناسی، ویروس‌شناسی، زیست‌شناسی سرطان و نظارت بر بیماری‌های عفونی است. فلوسایتومتری فناوری است که تجزیه‌وتحلیل چند پارامتری سریع سلول‌های منفرد در محلول را ارائه می‌دهد. از لیزر به‌عنوان منابع نور برای تولید سیگنال‌های نور پراکنده و فلورسنت که توسط فلوسایتومتر خوانده می‌شوند، استفاده می‌کند. این سیگنال‌ها به سیگنال‌های الکترونیکی تبدیل می‌شوند که توسط کامپیوتر آنالیز می‌شوند و به فرمت استاندارد نوشته می‌شوند. جمعیت سلولی را می‌توان بر اساس ویژگی‌های فلورسنت یا پراکندگی نور آن‌ها تجزیه‌وتحلیل و کرد. انواع معرف‌های فلورسنت در فلوسایتومتری مورد استفاده قرار می‌گیرند، از جمله آنتی‌بادی‌های کونژوگه یا متصل شده به فلورسنت، رنگ‌های متصل به DNA، رنگ‌های زیستی، رنگ‌های شاخص یونی و پروتئین‌های بیان‌کننده فلورسنت. تجزیه‌وتحلیل فلوسایتومتری را می‌توان با استفاده از هیستوگرام‌ها، نمودار چگالی و نقطه‌ای و نمودار‌های کانتور انجام داد، که می‌تواند به تجسم داده‌ها و شناسایی الگوها یا روندها کمک کند.