تکنیک لوسیفراز | چیستی، ویژگی‌ها، عملکرد، معایب و مزایا

تکنیک لوسیفراز (سنجش گزارشگر لوسیفراز ) یکی از روش‌های پیشرفته در زیست‌شناسی مولکولی است که به دلیل قابلیت‌های منحصربه‌فرد خود در مطالعه فرآیندهای زیستی و بیان ژن در سطح رونویسی مورد توجه قرار گرفته است. این تکنیک از آنزیم لوسیفراز، که مسئول تولید نور در موجودات شب‌تاب مانند کرم‌های شب‌تاب است، بهره می‌برد. استفاده از لوسیفراز به پژوهشگران این امکان را می‌دهد تا با تبدیل سیگنال‌های شیمیایی به نور، به‌صورت دقیق و غیرتهاجمی فعالیت‌های بیولوژیکی را در سلول‌ها و ارگانیسم‌ها مشاهده و اندازه‌گیری کنند. به همین دلیل، لوسیفراز به‌عنوان یکی از ابزارهای قدرتمند در زمینه‌های مختلفی چون تحقیقات سرطان، بررسی فعالیت‌های ژنی، و توسعه داروها کاربرد گسترده‌ای پیدا کرده است. برای آشنایی بیشتر با تکنیک لوسیفراز ، با مجله بیوزوم همراه باشید.

تکنیک لوسیفراز چیست؟

سنجش گزارشگر لوسیفراز (Luciferase Reporter Assay) یک تکنیک آزمایشگاهی است که برای مطالعه و اندازه‌گیری فعالیت‌های ژنی و تنظیم ژن‌ها در سلول‌ها استفاده می‌شود. در این روش، ژن مورد نظر به یک ژن گزارشگر متصل می‌شود که تولید کننده آنزیم لوسیفراز است. سپس این ترکیب به سلول‌های هدف وارد می‌شود.

هنگامی که ژن مورد نظر فعال می‌شود، ژن لوسیفراز نیز بیان شده و آنزیم لوسیفراز تولید می‌شود. این آنزیم با واکنش دادن با بسترهای شیمیایی مشخص، نور تولید می‌کند. شدت نور تولید شده با فعالیت ژن مورد بررسی نسبت مستقیم دارد، بنابراین با اندازه‌گیری میزان نور تولید شده، می‌توان میزان فعالیت ژن مورد نظر را سنجید.

تکنیک لوسیفراز می‌تواند به محققان کمک کند تا ارتباط عملکردی بین یک پروتئین و مقدار محصول یک ژن را آزمایش کنند، اما قادر به آزمایش برهمکنش مستقیم بین پروتئین و ناحیه تنظیم‌کننده یک ژن هدف نیست.

برخی از ویژگی‌های مهم تکنیک لوسیفراز

فوق‌العاده حساس

تکنیک سنجش گزارشگر لوسیفراز به دلیل استفاده از آنزیم لوسیفراز بسیار حساس است. آنزیم لوسیفراز برای تولید نور با بستر خود واکنش نشان می‌دهد، که این فرآیند نوری از دقت بالایی برخوردار است و می‌تواند مقادیر بسیار کمی از فعالیت ژنی را تشخیص دهد، به طوری که می‌تواند حتی مقادیر نانوگرمی یا پیکوگرمی بیان ژن را تشخیص دهد. در شرایط آزمایشگاهی، برخی از مطالعات نشان داده‌اند که سیستم‌های لوسیفراز می‌توانند حتی مقادیری به کمی 1 پیکوگرم یا کمتر را تشخیص دهند.

قابل تکرار

قابلیت تکرارپذیری بالا به معنای آن است که نتایج به دست آمده از آزمایشات مختلف، حتی در شرایط مختلف آزمایشگاهی یا با استفاده از نمونه‌های مختلف، قابل مقایسه و قابل اعتماد هستند.نکته: در زمینه‌ی تکنیک‌های مولکولی و سلولی، قابلیت تکرارپذیری تکنیک لوسیفراز می‌تواند تا حد زیادی به کنترل دقیق شرایط آزمایش و استانداردسازی فرایندها بستگی داشته باشد. برای مثال، ثبات آنزیم لوسیفراز، دقت در تهیه و استفاده از بسترهای واکنش، و استاندارد کردن دستگاه‌های تشخیص نور همگی می‌توانند بر نتایج تأثیر بگذارند. با این حال، با رعایت دقیق پروتکل‌ها و شرایط آزمایش، سنجش گزارشگر لوسیفراز معمولاً نتایج بسیار دقیق و تکرارپذیری ارائه می‌دهد.

سازگار با گزارشگران کنترل داخلی

تکنیک سنجش گزارشگر لوسیفراز معمولاً با استفاده از گزارشگران کنترل داخلی سازگار است، که این امکان به تحلیل دقیق‌تر و مقایسه‌پذیری بهتر نتایج کمک می‌کند. گزارشگران کنترل داخلی معمولاً شامل ژن‌هایی هستند که میزان بیان ثابتی دارند و به عنوان معیاری برای نرمال‌سازی نتایج استفاده می‌شوند تا تأثیر تغییرات در شرایط آزمایشگاهی یا تفاوت‌های سلولی را جبران کنند.

در مورد تکنیک لوسیفراز، اغلب از دو نوع آنزیم گزارشگر در یک آزمایش استفاده می‌شود: یکی به عنوان هدف تحقیق (مثلاً تحت تأثیر ترکیب دارویی یا شرایط خاص) و دیگری به عنوان کنترل داخلی. به عنوان مثال، ممکن است آنزیم لوسیفراز نوری به عنوان گزارشگر اصلی و آنزیم رنیلا لوسیفراز یا آنزیم‌های دیگر مانند β-galactosidase به عنوان کنترل داخلی استفاده شوند. این امکان فراهم می‌کند که در یک آزمایش، دو پارامتر مختلف اندازه‌گیری شود، که این کمک می‌کند تا نتایج حاصل از تغییرات محیطی یا بیولوژیکی معتبر و قابل اتکا باشند.

استفاده از چنین سیستم‌های دوگانه‌ای از گزارشگران به تحقیقات اجازه می‌دهد تا با دقت بیشتری نتایج را تجزیه و تحلیل کنند و اطمینان حاصل کنند که نتایج به دست آمده تا حد ممکن خالی از خطاهای ناشی از نوسانات تجربی باشند.

استفاده از معرف‌های غیر رادیواکتیو

در تکنیک‌های سنجش گزارشگر سنتی، گاهی از مواد رادیواکتیو برای برچسب‌زنی بیومولکول‌ها استفاده می‌شود، اما این کار ریسک‌های بهداشتی و محیطی به همراه دارد. در مقابل، استفاده از معرف‌های غیررادیواکتیو در تکنیک لوسیفراز، مثل بسترهای شیمیایی که با آنزیم لوسیفراز واکنش داده و نور تولید می‌کنند، یک روش امن‌تر و سازگار با محیط زیست است. این بسترها، هنگامی که آنزیم لوسیفراز بیان شده در نمونه‌ها با آن‌ها واکنش می‌دهد، نور زیادی تولید می‌کنند، که این نور توسط دستگاه‌های تشخیصی قابل اندازه‌گیری است.

بنابراین، استفاده از این معرف‌های غیررادیواکتیو نه تنها به افزایش ایمنی و سهولت در انجام آزمایشات کمک می‌کند، بلکه به دلیل حساسیت بالای این تکنیک، امکان تحلیل دقیق و سریع تغییرات بیان ژنی را فراهم می‌آورد بدون آنکه نیاز به استفاده از تجهیزات خاص برای کار با مواد رادیواکتیو باشد.

برخی از کاربردهای تکنیک لوسیفراز

برخی از کاربردهای تکنیک لوسیفراز عبارت‌اند از:

• تجزیه‌وتحلیل بیان ژن
• تحلیل ساختار پروموتر
• تجزیه‌وتحلیل SNPs
• تحقیق و درمان ضدویروسی
• سنجش سمیت سلولی
• کشف دارو (مانند داروهایی که گیرنده‌های جفت شده با پروتئین G را هدف قرار می‌دهند)

تکنیک لوسیفراز چگونه کار می‌کند؟

سنجش لوسیفراز گزارشگر یک روش مهم و پرکاربرد در تحقیقات بیولوژیک و پزشکی است که برای اندازه‌گیری فعالیت ژنی و تعیین تأثیر عوامل مختلف بر بیان ژن استفاده می‌شود. این روش چندین مرحله اصلی دارد:

طراحی ناقل ژنتیکی

ابتدا، ژن مورد نظر که قرار است مورد مطالعه قرار گیرد، به یک ژن گزارشگر، معمولاً ژن کدکننده آنزیم لوسیفراز، از طریق یک ناقل ژنتیکی (مانند پلاسمید) متصل می‌شود. این ژن گزارشگر به طور معمول به یک عنصر تنظیم‌کننده (مثل پروموتر یا انهانسر) که فعالیت ژنی را تحت تأثیر قرار می‌دهد و احتمالاً بر رونویسی تأثیر می‌گذارد ، وصل می‌شود. هنگامی که این سیستم فعال شود، آنزیم لوسیفراز تولید می‌شود.

ترانسفکشن

سلول‌های هدف با این ناقل‌های ژنتیکی حاوی گزارشگر لوسیفراز ترانسفکت می‌شوند، یعنی ناقل حاوی ژن گزارشگر و ژن مورد نظر وارد سلول‌ها می‌شود و چند روز به سلول اجازه ی رشد داده می‌شود.

اندازه گیری فعالیت لوسیفراز

پس از مدتی که ، سلول‌ها تحت شرایط خاصی قرار می‌گیرند که می‌تواند شامل تیمار با دارو یا تغییرات محیطی باشد و لیز می‌شوند. سپس، فعالیت آنزیم لوسیفراز با افزودن یک سوبسترای خاص (معمولاً لوسیفرین) به محیط کشت سلول‌ها اندازه‌گیری می‌شود. لوسیفرین یک مولکول کوچک است که در حضور آنزیم لوسیفراز و مولکول‌های ATP، نور تولید می‌کند. اندازه‌گیری فعالیت لوسیفراز بر اساس میزان سیگنال بیولومینسانس انجام می‌شود.

تجزیه و تحلیل

میزان نور تولید شده که به وسیله دستگاه‌های مخصوص تشخیص نور (مثل لومینومتر) اندازه‌گیری می‌شود، نشان‌دهنده میزان فعالیت لوسیفراز و در نتیجه میزان فعالیت ژنی متصل به آن است. این اطلاعات می‌توانند برای تعیین میزان تأثیر عوامل مختلف بر فعالیت ژنی مورد استفاده قرار گیرند. اگر پروتئین موردنظر بیان ژن هدف را فعال کند، میزان سیگنال تولیدشده افزایش می‌یابد. بااین‌حال، اگر پروتئین بیان ژن را مهار کند، سلول‌ها لوسیفراز کمتری تولید می‌کنند و در نتیجه، این نمونه‌ها سیگنال کمتری نسبت به کنترل مثبت نشان خواهند داد.

نحوه انتخاب بافر لیز سلولی برای تکنیک لوسیفراز

انتخاب بافر لیز سلولی مناسب برای تکنیک سنجش لوسیفراز گزارشگر بسیار مهم است زیرا این بافر نقش کلیدی در استخراج و حفظ فعالیت آنزیم لوسیفراز دارد. بافرهای لیز سلولی باید به گونه‌ای انتخاب شوند که سلول‌ها را مؤثر و بدون تخریب فعالیت آنزیم لوسیفراز لیز کنند. در ادامه به چند نکته‌ی مهم در انتخاب بافر مناسب اشاره می‌شود:

1- سازگاری: هنگام انتخاب یک بافر برای لیز کردن سلول‌ها برای تکنیک لوسیفراز، از موادی استفاده می‌شود که با معرف‌های بیولومینسانس سازگار هستند. این بدان معنی است که بافر باید بتواند از فعالیت لوسیفراز محافظت کند، بنابراین با فعالیت معرف بیولومینسانس و حساسیت سیگنال تداخلی ایجاد نمی‌کند. موادی که ممکن است باعث کدورت یا فلورسانس پس‌زمینه شوند باید از ترکیبات بافر حذف شوند.

به‌عنوان‌مثال، بافرهای لیز لوسیفراز GoldBio حساسیت سیگنال را حفظ می‌کنند و با کیت‌های سنجش لوسیفراز TM Illumination به‌خوبی کار می‌کنند. برای سنجش گزارشگر لوسیفراز Firefly، از بافر لیز لوسیفراز استفاده می‌شود، درحالی‌که برای سنجش گزارشگر لوسیفراز Renilla، بافر لیز غیرفعال (passive lysis buffer) انتخاب می‌گردد.

2- حفظ فعالیت آنزیمی: بافر لیز باید فاقد هرگونه مولفه‌ی مهارکننده‌ی فعالیت آنزیم لوسیفراز باشد. به عنوان مثال، سنگینی فلزات یا مواد شیمیایی اکسید کننده نباید در بافر حضور داشته باشند زیرا می‌توانند آنزیم را غیرفعال کنند.

3- محافظت از پروتئین‌ها: افزودن مهارکننده‌های پروتئاز به بافر لیز سلولی می‌تواند مانع از تجزیه پروتئین‌ها شود و بدین ترتیب آنزیم لوسیفراز در طی فرآیند لیز سلولی ثابت و فعال باقی می‌ماند.

طرز تهیه محلول لوسیفرین مورد استفاده در تکنیک لوسیفراز

سوبستراهای رایج برای تکنیک لوسیفراز، لوسیفرین (luciferin) و کوئلنترازین (coelenterazine) هستند. هنگام تهیه محلول‌های استوک لوسیفرین، تهیه آن در حجم زیاد برای آزمایش‌های خود مفید است.

تهیه محلول D-Luciferin پتاسیم یا سدیم استوک:

1. محلول استوک لوسیفرین 15 میلی گرم بر میلی‌لیتر (X100) در درجه زیست‌شناسی مولکولی H₂O تهیه می‌شود.

توجه: برای بهترین نتیجه، محلول استوک لوسیفرین باید فوراً استفاده شود، اما می‌توان آن را به بخش‌های کوچک تقسیم کرده و تا 1 ماه در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری کرد.

2. غلظت نهایی سوبسترای لوسیفرین در سنجش لومینسانس لوسیفراز باید: 150 میکروگرم بر میلی‌لیتر (471 میکرومولار برای نمک لوسیفرین-پتاسیم، یا 468 میکرومولار برای نمک لوسیفرین-سدیم) باشد.

تهیه محلول استوک کوئلنترازین:

1. 1 میلی‌گرم کوئلنترازین به 1 میلی‌لیتر متانول اسیدی شده اضافه می‌شود (50 میکرولیتر HCl غلیظ به 10 میلی‌لیتر متانول اضافه می‌گردد).
2. محلول تقسیم‌بندی شده و در دمای 80- درجه سانتی‌گراد تا 4 هفته قابل نگهداری است.
3. برای استفاده، یخ ویال ذوب‌شده و 25.41 میکرولیتر از محلول استوک کوئلنترازین به 40 میلی‌لیتر DPBS (غلظت نهایی 1.5 میکرومولار) اضافه می‌شود.

فعالیت لوسیفراز چگونه اندازه‌گیری می‌شود؟

برای اندازه‌گیری فعالیت لوسیفراز لیزهای سلولی، به یک پلیت چند چاهکی یا یک ویال حاوی لیزهای سلولی و یک لومینومتر نیاز دارید. این دستگاه گسیل فوتون تولیدشده از واکنش لوسیفراز را تشخیص می‌دهد و واحد اندازه‌گیری به‌صورت واحدهای نور نسبی (RLU) خارج می‌شود. معمولاً، برای بسیاری از سنجش‌های لوسیفراز، نیازی به انتخاب طول‌موج خاصی نخواهید داشت.

برای افزایش ثبات نتایج، بهتر است از یک لومینومتر با انژکتور برای انواع خاصی از سنجش لوسیفراز (مانند سنجش گزارشگر لوسیفراز دوگانه) استفاده شود. انژکتور یک سوبسترا را به لیز سلولی توزیع می‌کند و خوانش چاهک‌ها بلافاصله شروع شده تا احتمال کاهش سیگنال را به حداقل برساند.

معایب استفاده از تکنیک لوسیفراز به‌عنوان گزارشگر

درحالی‌که سنجش گزارشگر لوسیفراز دارای مزایای زیادی است، معایبی نیز دارد:

1. سلول‌ها معمولاً باید قبل از تعیین کمیت رونویسی، لیز شوند (اگرچه راه‌هایی برای اندازه‌گیری فعالیت لوسیفراز در سلول‌های زنده وجود دارد).
2. لوسیفراز برای تبدیل سوبسترا به ATP نیاز دارد. این بدان معنی است که وضعیت متابولیک سلول می‌تواند بر نتیجه تأثیر بگذارد و سوگیری را در نتایج ایجاد کند. بااین‌حال، می‌توان با استفاده از لوسیفرازهای مستقل از ATP بر این مشکل غلبه کرد.
3. پروموترهای نشتی گاهی اوقات می‌توانند منجر به افزایش سیگنال پس‌زمینه شوند، اما گزارشگران ناپایداری ایجاد شده‌اند که برای کمک به غلبه بر این مشکل به‌سرعت تخریب می‌شوند.

مزایای استفاده از تکنیک لوسیفراز برای مطالعه بیان ژن

از این روش گزارشگر می‌توان برای مطالعه بیان ژن و همچنین سایر اجزای سلولی و رویدادهایی که در تنظیم ژن نقش دارند استفاده کرد.

1. حساسیت فوق‌العاده آن امکان تعیین کمیت حتی تغییرات کوچک در رونویسی را فراهم می‌کند و در دسترس بودن نتایج در عرض چند دقیقه پس از تکمیل آزمایش، آن را جذاب‌تر می‌کند.
2. در مقایسه با گزارشگران فلورسنت، تکنیک لوسیفراز سیگنال پس‌زمینه پایینی دارد.
3. در مقایسه با برخی دیگر از روش‌های گزارشگر که ممکن است شامل استفاده از مواد رادیواکتیو باشند، تکنیک‌های مبتنی بر لوسیفراز از مواد غیررادیواکتیو استفاده می‌کنند که سبب ایمنی بالای آن شده است.

جمع‌بندی

سنجش گزارشگر لوسیفراز یک روش رایج در زیست‌شناسی مولکولی است که از آنزیم لوسیفراز و سوبسترایی مانند لوسیفرین برای مطالعه تنظیم ژن در سطح رونویسی استفاده می‌کند. میزان نورافشانی حاصل از واکنش لوسیفرین با لوسیفراز تولیدشده در سلول‌ها نشان‌دهندهی سطح فعالیت راه‌انداز ژن در پلاسمیدها است. هرچه نور تولیدشده بیشتر باشد، فعالیت راه‌انداز ژن نیز بیشتر است. این تکنیک برای ردیابی و اندازه‌گیری بیان یک ژن کلون‌شده کاربرد دارد و در زیست‌شناسی استفاده‌های متعددی دارد.