PCR چیست | اجزا، مراحل انجام، انواع و کاربرد
در علم پزشکی و تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی، تکنیک پی‌سی‌آر برای تولید هزاران یا حتی میلیون‌ها نسخه از یک بخش خاص از DNA، مانند یک ژن، استفاده می‌شود. این تکنیک کاربردهای گسترده‌ای از جمله مراحل اولیه پردازش DNA برای توالی‌یابی، تولید پروفایل‌های DNA پزشکی قانونی از مقادیر ناچیز DNA، و تشخیص وجود یا عدم وجود یک ژن به‌منظور شناسایی عوامل بیماری‌زا در طول عفونت دارد. در ادامه با مجله بیوزوم همراه باشید تا به این پرسش که PCR چیست، پاسخ دهیم و بیشتر با تکنیک پی‌سی‌آر، اجزای تشکیل‌دهنده و کاربردهای این تکنیک و انواع آن آشنا شویم.
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک آزمایشگاهی رایج است که برای ساختن تعداد زیادی کپی (میلیون‌ها یا حتی میلیاردها کپی!) از یک ناحیه خاص از DNA استفاده می‌شود. این ناحیه DNA می‌تواند هر بخشی باشد که آزمایشگر به آن علاقه دارد. برای مثال، ممکن است ژنی باشد که محقق می‌خواهد عملکرد آن را بفهمد، یا نشانگر ژنتیکی باشد که توسط محققان پزشکی قانونی برای تطبیق DNA صحنه جرم با مظنونین استفاده می‌شود.
بیشتر بخوانید: دی ان ای (DNA) چیست؟ – به زبان ساده
به طور معمول، هدف PCR ساختن مقدار کافی از ناحیه DNA هدف است که بتوان آن را آنالیز کرده یا در روش دیگری استفاده کرد. به‌عنوان‌مثال، DNA تکثیر شده توسط PCR ممکن است برای تعیین توالی فرستاده شده یا با ژل الکتروفورز تجسم شود، یا برای آزمایش‌های بیشتر در پلاسمید کلون شود.
نکته: تکنیک PCR در بسیاری از زمینه‌های زیست‌شناسی و پزشکی از جمله تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی، تشخیص پزشکی و حتی برخی از شاخه‌های اکولوژی استفاده می‌شود.
اجزای تشکیل‌دهنده PCR چیست؟
- DNA الگو که باید کپی شود.
- پرایمرها: امتداد کوتاهی از DNA یا RNA ، به طول ۲۰ تا ۳۰ باز، که به هر دو طرف ناحیه DNA موردنظر اتصال یافته و نقطه شروع PCR را مشخص می‌کنند.
- بازهای نوکلئوتیدی DNA که به‌عنوان dNTP نیز شناخته می‌شوند. بازهای DNA (آدنین، تیمین، سیتوزین و گوانین) بلوک‌های سازنده DNA بوده و برای ساخت رشته جدید DNA مورد نیاز هستند.
- آنزیمی به نام Taq polymerase که بازها را به‌توالی کپی شده اضافه می‌کند.
- یک بافر برای اطمینان از شرایط مناسب برای واکنش.
استفاده از ژل الکتروفورز برای تجسم نتایج PCR
نتایج یک واکنش PCR معمولاً با استفاده از ژل الکتروفورز (Gel electrophoresis) قابل‌مشاهده است. ژل الکتروفورز تکنیکی است که در آن قطعات DNA توسط جریان الکتریکی از طریق یک ماتریس ژل کشیده شده و قطعات DNA را بر اساس اندازه جدا می‌کند. معمولاً یک استاندارد یا نردبان DNA (DNA ladder) گنجانده می‌شود تا اندازه قطعات در نمونه PCR تعیین شود.
بیشتر بخوانید: تکنیک کروماتوگرافی | چیستی، اصول، فرآیند و انواع
قطعات DNA با طول یکسان یک “باند” روی ژل تشکیل می‌دهند که اگر ژل با یک‌رنگ متصل‌شونده به DNA، مثل اتیدیوم بروماید (Ethidium Bromide)، رنگ‌آمیزی شود، با چشم قابل‌مشاهده است. برای مثال، یک واکنش PCR که یک قطعه ۴۰۰ جفت بازی تولید می‌کند، روی ژل شبیه به شکل زیر خواهد بود:
یک باند DNA حاوی کپی‌های بسیار زیادی از ناحیه DNA هدف است، نه فقط یک یا چند نسخه. از آنجایی که DNA میکروسکوپی است، باید نسخه‌های زیادی از آن وجود داشته باشد تا بتوانیم آن را با چشم ببینیم. این موضوع بخش بزرگی از دلیل اهمیت بالای PCR است، در واقع تکنیک پی‌سی‌آر به‌اندازه کافی کپی از یک توالی DNA تولید می‌کند تا محققان بتوانند آن ناحیه از DNA را ببینند یا دست‌کاری کنند.
در ادامه با مراحل و انواع PCR بیشتر آشنا خواهیم شد.
مراحل PCR چیست؟
مراحل اصلی تکنیک پی‌سی‌آر عبارت‌اند از:
- واسرشتگی یا دناتوراسیون (Denaturation)
- اتصال (Annealing)
- گسترش (Extension)
واسرشتگی یا دناتوراسیون
واسرشتگی یا دناتوره‌شدن در دمای ۹۶ درجه سانتی‌گراد اتفاق افتاده و طی افزایش دمای محیط، باز شدن دو رشته الگو از یکدیگر رخ می‌دهد. این فرایند را دناتوراسیون یا واسرشتگی می‌نامند. در گام بعد، هر کدام از تک‌رشته‌ای‌های حاصل از باز شدن مولکول دو رشته‌ای DNA، به‌عنوان الگو به کار گرفته می‌شوند
نکته: قبل از آغاز اولین چرخه دمایی، به‌منظور حذف کامل ساختارهای ثانویه یا پیچ‌وتاب خوردگی‌های رشته الگو، ویال حاوی اجزای واکنش، تا رسیدن به دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد، گرم شده و حدود ۵ دقیقه در این دما باقی می‌ماند. این مرحله به دلیل قرارگیری رشته الگو به‌صورت یک تک‌رشته‌ای خالص در معرض آنزیم انجام می‌شود. به این مرحله واسرشتگی آغازین (Initial Denaturation) یا دناتوراسیون اولیه می‌گویند.
اتصال
اتصال معمولاً در بازه دمایی بین ۵۵ تا ۶۵ درجه سانتی‌گراد اتفاق افتاده و طی کاهش دمای محیط، امکان اتصال پرایمرها به توالی‌های مکمل خود فراهم می‌گردد. پرایمرها در جهت 3′→5′ رشته الگو به آن اتصال یافته در حالی که جهت خود پرایمر 5′→3′ است. در این حالت، آنزیم پلیمراز، سر 3′ آن‌ها را که حاوی گروه هیدروکسیل آزاد است، در اختیار گرفته تا همانندسازی DNA را در ناحیه هدف، شروع کند.
یادآوری: پرایمر مولکول نوکلئوتیدی کوچکی است که یک نقطه شروع را در اختیار آنزیم پلیمراز قرار می‌دهد. این نقطه شروع، گروه هیدروکسیل آزاد موجود در انتهای ۳ پریم آخرین نوکلئوتید مولکول پرایمر است.
گسترش یا طویل‌سازی
مرحله گسترش که طویل‌سازی نیز نامیده می‌شود، در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد اتفاق افتاده و طی افزایش نسبی دمای محیط، شرایط مناسب برای فعالیت آنزیم Taq پلیمراز و ساخت رشته جدید، فراهم می‌شود.
نکته: پس از انجام آخرین چرخه دمایی، به‌منظور فراهم‌کردن زمان لازم برای اینکه آنزیم Taq پلیمراز، عملکرد ساخت رشته‌های ناقص را تکمیل کند، ویال نمونه برای مدت حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد، باقی می‌ماند. به این مرحله، گسترش نهایی یا طویل‌سازی نهایی (Final Extension) می‌گویند.
تکنیک پی‌سی‌آر در دستگاهی به نام ترموسایکلر (Thermocycler) انجام می‌گردد. طول انجام هر واکنش ساده، بین ۲ تا ۴ ساعت است و طی آن، مراحل سه‌گانه اشاره شده، بین ۲۵ تا ۳۵ بار تکرار می‌شوند. درصورتی‌که PCR موفقیت‌آمیز باشد، تعداد کپی‌های ناحیه موردنظر، از یک یا تعدادی معدود، به میلیاردها کپی خواهد رسید.
دلیل رشد تصاعدی تعداد نسخه‌ها این است که در هر بار تکرار، علاوه بر مولکول‌های اولیه که به‌عنوان الگو به کار می‌روند، مولکول‌های ساخته شده در تکرارهای قبلی نیز به این مجموعه اضافه می‌گردند. همچنین، ویال آزمایش، حاوی مقادیر زیادی پرایمر و آنزیم است که به این رشته‌ها اتصال یافته و سنتز رشته‌های جدید را کاتالیز می‌کنند. به این ترتیب، تعداد نسخه‌ها در هر دور PCR دوبرابر خواهد شد. برای به‌دست‌آوردن افزایش تعداد نسخه‌ها از فرمول N=2n استفاده می‌شود که در آن N، تعداد نسخه‌ها در دور n ام واکنش را نشان می‌دهد.
خلاصه مراحل PCR چیست ؟
پس خلاصه مراحل یک واکنش PCR ساده به شرح زیر است:
- مرحله واسرشتگی اولیه یک تکرار دارد، در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد حدود ۵ دقیقه زمان می‌برد.
- مرحله واسرشتگی سی تکرار دارد، در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد حدود ۳۰ ثانیه زمان می‌برد.
- مرحله اتصال سی تکرار دارد، در دمای ۵۵ درجه سانتی‌گراد حدود ۳۰ ثانیه زمان می‌برد.
- مرحله گسترش سی تکرار دارد، در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد حدود ۳۰ ثانیه زمان می‌برد.
- مرحله گسترش نهایی یک تکرار دارد، در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد حدود ۱۰ دقیقه زمان می‌برد.
- مرحله نگهداری نهایی در دمای ۱۰ درجه سانتی‌گراد تا خاموش‌کردن دستگاه زمان می‌برد.
انواع PCR چیست؟
با ایجاد اندکی تغییر در اجزا یا شرایط دمایی PCR، می‌توان از آن برای اهداف گوناگونی استفاده کرد. انواع مختلف تکنیک پی‌سی‌آر که به این ترتیب ابداع شده‌اند عبارت‌اند از:
- ریل‌تایم PCR یا PCR کمی، qPCR و RT-PCR
- PCR معکوس (Reverse PCR)
- PCR چندگانه (Multiple PCR)
- PCR داخلی (Nested PCR)
- PCR بادقت بالا (High Fidelity PCR)
- PCR سریع (Fast PCR)
- PCR با شروع گرم (Hot Start PCR)
- PCR مناطق غنی از CG (GC-Rich PCR)
- PCR نواحی بلند (Long-range PCR)
- PCR با پرایمرهای تصادفی (Arbitrary Primed PCR)
کاربرد PCR چیست؟
همان‌طور که اشاره شد، با استفاده از تکنیک PCR، نسخه‌های بسیاری از یک مولکول هدف به دست می‌آیند که می‌توان آن‌ها را در مراحل بعدی آزمایش به کار گرفت. بعضی از کاربردهای رایج این تکنیک عبارت‌اند از:
بیشتر بخوانید: الکتروفورز | چیستی، انواع، اصول و عملکرد
- شناسایی ژن‌های دخیل در یک بیماری یا اختلال
- شناسایی عامل بیماری عفونی
- تشخیص پزشکی مناسب
- تکثیر یک ناحیه از رونوشت ژن (Reverse Transcriptase PCR)
- احراز هویت
- کلونینگ ناحیه موردنظر
- تخمین دقیق تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن (Real-Time PCR)
- تخمین تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن در مقایسه با ژن دیگر (Semi-quantitative PCR)
نکته: در شناسایی ژن‌های مرتبط با یک اختلال ژنتیکی، DNA فرد مشکوک به‌عنوان الگو به کار گرفته شده و با DNA فرد سالم مقایسه می‌گردد. هر گونه جهش ژنتیکی، منجر به تغییر اندازه توالی موردنظر خواهد شد. نتیجه آزمایش، با جداسازی قطعات بر روی ژل، قابل‌مشاهده است.
جمع‌بندی مطلب PCR چیست؟
همان‌طور که اشاره شد، تکنیک پی‌سی‌آر، روشی است که میلیون‌ها نسخه از بخشی از DNA موردنظر محققان را در اختیار آن‌ها قرار می‌دهد، تا بنا بر هدف مطالعه، مورد آنالیز قرار گیرد. اجزای مورد نیاز برای انجام واکنش پی‌سی‌آر شامل نمونه DNA الگو، پرایمر، نوکلئوتیدها، Taq پلیمراز، بافر و ویال واکنش بوده و همچنین سه مرحله اصلی آن، دناتوراسیون، گسترش و طویل‌سازی است. انواع مختلف تکنیک پی‌سی‌آر وجود دارد که بر اساس هدف مطالعه و کاربرد موردنظر محققان مورد استفاده قرار می‌گیرند.
