تکنیک وسترن‌بلات | چیستی، اهداف و مراحل
در بسیاری از مطالعات آزمایشگاهی، مانند تشخیص یا بررسی بیماری‌ها، ارزیابی موفقیت یا شکست آزمایش‌های دست‌کاری ژنتیکی، یا شناسایی پروتئین‌های بالقوه آلرژی‌زا در نمونه‌های غذایی، نیاز به شناسایی حضور، عدم حضور، و اندازه‌گیری یک پروتئین خاص وجود دارد. برای این منظور، پروتئین هدف باید از سایر پروتئین‌ها که ممکن است ویژگی‌ها یا اندازه مشابهی داشته باشند، تفکیک شود. تکنیک وسترن‌بلات یکی از روش‌های کارآمدی است که این توانایی را فراهم می‌کند. در ادامه، با مجله بیوزوم همراه باشید تا بیشتر درباره تکنیک وسترن‌بلات بدانیم.
تکنیک وسترن‌بلات که گاهی اوقات ایمونوبلات پروتئینی (protein immunoblot) نیز نامیده می‌شود، یک تکنیک مبتنی بر آنتی‌بادی است که برای تشخیص وجود، اندازه و فراوانی پروتئین‌های خاص در یک نمونه استفاده می‌شود. این تکنیک در سال 1979 توسط هری تاوبین (Harry Towbin) و همکارانش توسعه یافت و بعداً به دلیل شباهت این تکنیک به ساترن‌بلات، وسترن‌بلات نام گرفت. به طور خلاصه، پروتئین‌ها در یک نمونه آبی با الکتروفورز جدا شده و پس از انتقال به غشای مناسب، نمونه‌ها با استفاده از آنتی‌بادی‌های خاص هدف کاوش می‌شوند. این آنتی‌بادی‌ها را می‌توان شناسایی کرده و اندازه و فراوانی پروتئین‌های متصل را در مقایسه با استانداردها یا کنترل‌های شناخته شده ارزیابی کرد.
بیشتر بخوانید: پروتئین چیست به زبان ساده
هدف وسترن‌بلات
دلایل مهم زیادی برای تشخیص وجود، اندازه و فراوانی پروتئین‌های هدف در یک نمونه وجود دارد و این دلایل می‌تواند شامل بسیاری از رشته‌های علمی باشد. علاوه بر وجود یا عدم وجود پروتئین، این تکنیک امکان ارزیابی موارد زیر را نیز فراهم می‌کند:
میان‌کنش پروتئین-DNA (Protein–DNA interactions)
اتصال پروتئین‌های متصل به DNA به توالی‌های DNA خاص برای فرایند تنظیم رونویسی حیاتی است. ساوث وسترن‌بلات (Southwestern blotting-شبیه به تکنیک وسترن‌بلات به جز اینکه غشا با DNA کاوش می‌شود) می‌تواند برای شناسایی فاکتورهای رونویسی در مطالعات تنظیم ژن استفاده شود.
میان‌کنش پروتئین-پروتئین (Protein–protein interactions)
این بررسی‌ها برای بسیاری از فرایندهای ضروری سلولی حیاتی هستند. تشخیص میان‌کنش پروتئین-پروتئین، با استفاده از گونه‌ای از تکنیک وسترن‌بلات معروف به فار وسترن‌بلات (far-western blotting)، می‌تواند به روشن‌شدن عملکرد و اختلال عملکرد سلولی کمک کند.
تغییرات پس از ترجمه (PTMs)
PTM (Post-translational modifications) بر تا شدن پروتئین تأثیر گذاشته و در نتیجه عملکرد و تنوع پروتئوم را گسترش می‌دهد. بااین‌حال، PTMهای نابجا با بیماری مرتبط هستند. در نتیجه، مطالعه آن‌ها بسیار موردتوجه محققان است و تکنیک وسترن‌بلات یکی از ابزارها برای انجام این کار فراهم می‌کند.
بیشتر بخوانید: رونویسی دنا و سنتز mRNA
تشخیص ایزوفرم پروتئین (Protein isoform detection)
پروتئین‌ها ممکن است در ایزوفرم‌های مختلف در حالت‌های سلولی مختلف با فعالیت‌ها یا اهداف متفاوت بیان شوند. از طرف دیگر، ممکن است برای فعال‌شدن به برش نیاز داشته باشند.
خصوصیات آنتی‌بادی (Antibody characterization)
وقتی آنتی‌بادی‌ها به‌عنوان ابزار یا دارو تولید می‌شوند، اعتبارسنجی و شناسایی آن‌ها برای اطمینان از عملکرد و ایمنی صحیح حیاتی است. به‌عنوان یک روش مبتنی بر آنتی‌بادی، تکنیک وسترن‌بلات یک تکنیک مفید در این فرایند است.
بیشتر بخوانید: سیستم ایمنی بدن انسان | چیستی، آناتومی، عملکرد و ناهنجاری‌ها
نقشه‌برداری اپی‌توپ (Epitope mapping)
درک اینکه چگونه و کجا آنتی‌بادی‌ها به پروتئین هدف خود متصل می‌شوند برای اهداف تحقیقاتی، تشخیصی و درمانی ارزشمند است. ابزارهای زیادی برای این هدف مورداستفاده قرار می‌گیرد و وسترن‌بلات به دلیل خاص بودن یکی از آن‌هاست.
محلی‌سازی پروتئین درون‌سلولی (Subcellular protein localization)
انجام تجزیه‌وتحلیل وسترن‌بلات از بخش‌های مختلف سلول امکان تعیین محل پروتئین‌های هدف در سلول را فراهم می‌کند. تکنیک وسترن‌بلات تک سلول بینش خوبی در این زمینه ارائه کرده و بر برخی از مسائل مربوط به واکنش متقابل آنتی‌بادی که توسط سایر سنجش‌های تک‌سلولی تجربه شده است، غلبه می‌کند.
بیشتر بخوانید: نگاهی بر انواع سلول ، سازندگان حیات
مراحل تکنیک وسترن‌بلات
شش مرحله در تکنیک وسترن‌بلات شامل آماده‌سازی نمونه، ژل الکتروفورز، انتقال پروتئین، مسدودکردن، انکوباسیون آنتی‌بادی و تشخیص و تجسم پروتئین وجود دارد.
آماده سازی نمونه
پروتئین‌ها را می‌توان از نمونه‌های مختلف مانند بافت‌ها یا سلول‌ها استخراج کرد. ازآنجایی‌که نمونه‌های بافت دارای درجه بالاتری از ساختار هستند، ابتدا بافت‌ها با ابزار مکانیکی مانند هموژنایزر یا فراصوت تجزیه می‌شوند. معمولاً از مهارکننده‌های پروتئاز و فسفاتاز برای جلوگیری از هضم نمونه در دماهای سرد استفاده می‌شود. پس از استخراج پروتئین، تشخیص غلظت پروتئین‌ها مهم است که اجازه می‌دهد توده پروتئین‌ها در هر چاهک بارگذاری شده و یک اسپکتروفتومتر اغلب برای غلظت پروتئین استفاده می‌شود.
ژل الکتروفورز
رایج‌ترین ژل مورداستفاده ژل‌های پلی‌آکریل آمید (PAG) و بافرهای بارگذاری شده با سدیم دودسیل سولفات (SDS) است. تکنیک وسترن‌بلات از دو نوع ژل آگارز استفاده می‌کند: ژل انباشته (stacking gel) که برای تغلیظ همه پروتئین‌ها در یک باند استفاده شده و ژل جداکننده (separating gel) که امکان جداسازی پروتئین‌ها را بر اساس وزن مولکولی آن‌ها فراهم می‌کند. هنگامی‌که ولتاژ اعمال می‌شود، پروتئین‌های کوچک‌تر در SDS-PAGE سریع‌تر مهاجرت می‌کنند. به طور معمول ژل‌های جداکننده در 5%، 8%، 10%، 12% یا 15% ساخته می‌شوند. وقتی درصد مناسبی از ژل جداکننده انتخاب شد، باید اندازه پروتئین‌های هدف را در نظر گرفت. هر چه وزن شناخته شده پروتئین کمتر باشد، درصد ژل بیشتری باید استفاده شود.
نکته: PAGE می‌تواند پروتئین‌های بین 5 تا 2000 کیلو دالتون را با توجه به اندازه منافذ یکنواخت که توسط غلظت‌های مختلف PAG کنترل می‌شود، جدا کند.
انتقال پروتئین
پس از جداسازی پروتئین‌ها با ژل الکتروفورز، پروتئین‌ها از داخل ژل روی یک غشای پشتیبان جامد منتقل شده تا پروتئین‌ها برای تشخیص آنتی‌بادی قابل‌دسترسی باشند. روش اصلی برای انتقال پروتئین الکتروبلات (electroblotting) نامیده می‌شود که از یک میدان الکتریکی عمود بر سطح ژل استفاده می‌کند تا پروتئین‌ها را از ژل بیرون کشیده و به داخل غشا حرکت کند. می‌توان آن را در شرایط نیمه‌خشک یا مرطوب انجام داد، درحالی‌که شرایط مرطوب معمولاً قابل‌اطمینان‌تر هستند؛ زیرا احتمال خشک‌شدن ژل کمتر است. غشا بین سطح ژل و فیلتر قرار گرفته و ساندویچ انتقال به‌صورت زیر ایجاد می‌شود: پد فیبر (اسفنج)، کاغذهای صافی، ژل، غشا، کاغذهای صافی، پد فیبر (اسفنج).
مسدود کردن
مسدودکردن یک مرحله مهم در تکنیک وسترن‌بلات برای جلوگیری از اتصال غیراختصاصی آنتی‌بادی‌ها به غشا است. رایج‌ترین مسدودکننده‌های معمولی BSA و شیرخشک بدون چربی هستند. هنگامی که غشا در محلول رقیق پروتئین‌ها قرار می‌گیرد، پروتئین‌ها به تمام نقاط غشا که پروتئین‌های هدف به آن‌ها متصل نشده‌اند، می‌چسبند. به‌این‌ترتیب، می‌توان “نویز” در محصول نهایی وسترن‌بلات را کاهش داد و نتایج واضح‌تری به دست آورد.
بیشتر بخوانید: غشای سلولی، دیواری قابل اعتماد
نکته: نویز باندی ناخواسته است که بر باندهای دیگر اثر نامطلوب گذاشته و باعث تغییر شکل و در نتیجه باعث اختلال در آن‌ها می‌شود.
انکوباسیون آنتی بادی
پس از مسدودشدن، زمانی که آنتی‌بادی اولیه با غشا انکوبه می‌شود، آنتی‌بادی اولیه به پروتئین هدف متصل می‌شود. انتخاب یک آنتی‌بادی اولیه به آنتی‌ژنی که باید شناسایی شود بستگی دارد. شستشوی غشا با محلول بافر آنتی‌بادی برای به‌حداقل‌رساندن پس‌زمینه مفید است و آنتی‌بادی‌های غیرمتصل را حذف می‌کند. پس از شستشو، غشا در معرض آنتی‌بادی ثانویه کونژوگه (conjugated secondary antibody) با آنزیم خاص قرار می‌گیرد. هنگام انجام انکوباسیون آنتی‌بادی ثانویه، آنتی‌بادی ثانویه نشان‌دار شده می‌تواند به آنتی‌بادی اولیه که با پروتئین‌های هدف واکنش داده، متصل شود. بر اساس گونه آنتی‌بادی اولیه، می‌توان آنتی‌بادی ثانویه مناسب را انتخاب کرد.
بیشتر بدانید: پراکسیداز تربچه کوهی (HRP) یک آنزیم متداول جفت شده با آنتی‌بادی‌های ثانویه برای تقویت سیگنال اهداف شناسایی شده است.
شناسایی و تجسم پروتئین
یک سوبسترا با آنزیمی که به آنتی‌بادی ثانویه متصل است واکنش می‌دهد تا ماده رنگی تولید کند. این فرایند درک چگالی سنجی و محل پروتئین هدف را ممکن کرده و تقریب اندازه با مقایسه باندهای پروتئین با نشانگر گرفته می‌شود. چندین سیستم تشخیص برای تجسم پروتئین موجود است، مانند تشخیص رنگ‌سنجی، تشخیص نورتابی شیمیایی، تشخیص رادیواکتیو و تشخیص فلورسنت.
نکته: سیستم الکتروشیمیلومینسانس (ECL) رایج‌ترین روش تشخیص است.
جمع‌بندی
همان‌طور که اشاره شد، تکنیک وسترن‌بلات در سال 1979 معرفی شده و یک روش متداول برای تجزیه و تحلیل پروتئین است. می‌توان از این تکنیک برای تجزیه و تحلیل پروتئین کیفی و نیمه کمی استفاده کرد. برای انجام وسترن بلات، سه عنصر اصلی وجود دارد، جداسازی پروتئین‌ها بر اساس اندازه، انتقال پروتئین‌ها به یک تکیه گاه جامد و علامت گذاری پروتئین‌ها توسط آنتی بادی‌های اولیه و ثانویه برای تشخیص و تجسم پروتئین.
