آر تی پی سی آر | چیستی، کاربرد، نحوه کار و ابزارها

تکنیک‌های تقویت و تشخیص نوکلئیک‌اسید مانند آر تی پی سی آر از مهم‌ترین ابزارهای مورداستفاده در تحقیقات بیولوژیکی امروزی هستند. دانشمندان در حوزه‌های مختلف علوم زیستی، از تحقیقات پایه گرفته تا بیوتکنولوژی، پزشکی، پزشکی قانونی و تشخیص بیماری‌ها، از این روش‌ها در طیف گسترده‌ای از کاربردها بهره می‌برند. در برخی موارد، تشخیص کیفی نوکلئیک‌اسید کافی است، اما برای کاربردهای دیگر، نیاز به تجزیه‌وتحلیل کمی وجود دارد. آر تی پی سی آر (Real-time PCR) تکنیکی است که می‌تواند هم برای تجزیه‌وتحلیل کیفی و هم کمی به کار رود. انتخاب بهترین روش برای هر کاربرد، نیازمند درک عمیقی از این فناوری است. با مجله بیوزوم همراه باشید تا بیشتر با آر تی پی سی آر (Real-time PCR) و کاربردهای گسترده آن آشنا شوید.

آر تی پی سی آر چیست؟ Real-Time PCR

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی (Real-time PCR) معمولاً برای اندازه‌گیری بیان ژن استفاده می‌شود. نسبت به ریزآرایه‌ها (microarrays) در تشخیص تغییرات کوچک در بیان حساس‌تر است؛ اما به ورودی RNA بیشتری نیاز داشته و کمتر با مطالعات با توان بالا سازگار است. برای مطالعات زیر مجموعه‌های کوچکی از ژن‌ها مناسب است. یکی از کاستی‌های اصلی آن این است که توالی ژن هدف خاص موردنظر باید مشخص باشد (بنابراین می‌توانید پرایمرهای PCR را طراحی کنید)؛ بنابراین آر تی پی سی آر (Real-time PCR) تنها برای مطالعه ژن‌های شناخته شده قابل‌استفاده است.

بیشتر بخوانید: ژن چیست؟ – به زبان ساده

 چه زمانی کاربرد دارد؟ PCR/qPCR

سنجش PCR/qPCR  ریل تایم به ابزار انتخابی برای تعیین سریع و حساس و تعیین کمیت اسیدنوکلئیک در نمونه‌های بیولوژیکی مختلف، با کاربردهای متنوعی مانند تجزیه‌وتحلیل بیان ژن، تشخیص ارگانیسم‌های اصلاح‌شده ژنتیکی در غذا و فنوتیپ‌سازی سرطان تبدیل شده است.

در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، سنجش qPCR به طور گسترده برای اندازه‌گیری کمی تعداد کپی ژن (gene dosage) در رده‌های سلولی تبدیل شده، یا وجود ژن‌های جهش‌یافته استفاده می‌شود. در ترکیب با PCR  رونویسی معکوس  (RT-PCR)، سنجش qPCR می‌تواند برای تعیین کمیت دقیق تغییرات در بیان ژن، به‌عنوان‌مثال، افزایش یا کاهش بیان در پاسخ به شرایط مختلف محیطی یا تیمار دارویی، با اندازه‌گیری تغییرات در سطوح mRNA سلول استفاده شود.

بیشتر بخوانید: نوکلئیک اسیدها، رازداران حیات

  آر تی پی سی آر چگونه کار می‌کند؟  Real-Time PCR

برای درک اینکه آر تی پی سی آر (Real-time PCR) چگونه کار می‌کند، آنالیز qPCR را با استفاده از یک نمودار تقویت معمولی نشان می‌دهند. در این نمودار، تعداد چرخه‌های PCR روی محور x و فلورسانس حاصل از واکنش تقویت که متناسب با مقدار محصول تقویت شده در لوله است، روی محور y نشان‌داده‌شده است.

نمودار تقویت دوفاز را نشان می‌دهد، یک‌فاز نمایی و به دنبال آن یک‌فاز سکون غیر نمایی. در طول فاز نمایی، مقدار محصول PCR در هر سیکل تقریباً دوبرابر می‌شود. با ادامه واکنش، اجزای واکنش مصرف شده و در نهایت یک یا چند جزء محدودکننده می‌شوند. در این مرحله، واکنش کند شده و وارد فاز سکون می‌شود.

در ابتدا، فلورسانس در سطوح پس‌زمینه باقی می‌ماند و افزایش فلورسانس قابل‌تشخیص نیست (چرخه‌های 1-18) حتی اگر محصول به صورت تصاعدی انباشته شود. در نهایت، محصول تقویت شده کافی برای تولید یک سیگنال فلورسانس قابل تشخیص جمع شده و شماره چرخه‌ای که در آن این اتفاق می افتد، چرخه کمی یا Cq نامیده می شود. از آنجایی که مقدار Cq در فاز نمایی زمانی که معرف‌ها محدود نیستند اندازه گیری می‌شود، از آر تی پی سی آر (Real-time PCR) می‌توان برای محاسبه مطمئن و دقیق مقدار اولیه الگوی موجود در واکنش بر اساس تابع نمایی شناخته شده که پیشرفت واکنش را توصیف می‌کند، استفاده کرد.

Cq یک واکنش عمدتاً با مقدار الگوی موجود در شروع واکنش تقویت تعیین می‌شود. اگر مقدار زیادی از الگو در شروع واکنش وجود داشته باشد، چرخه‌های تقویت نسبتاً کمی برای جمع‌آوری محصول کافی برای ایجاد سیگنال فلورسانس در بالای پس‌زمینه موردنیاز است؛ بنابراین، واکنش، Cq کم یا زودرس خواهد داشت. در مقابل، اگر مقدار کمی از الگو در شروع واکنش وجود داشته باشد، چرخه‌های تقویت بیشتری برای افزایش سیگنال فلورسانس از پس‌زمینه موردنیاز خواهد بود؛ بنابراین واکنش، Cq بالا یا دیررس خواهد داشت. این رابطه پایه و اساس جنبه کمی آر تی پی سی آر (Real-time PCR) را تشکیل می‌دهد.

بیشتر بخوانید: RNA چیست؟ – به زبان ساده

RNA جداسازی

جمع‌آوری نمونه (Sample Collection)

برای جداسازی RNA و تعیین کمیت بیان ژن، ماده نمونه باید تاحدامکان همگن باشد. اگر نمونه بافت از انواع مختلف سلول تشکیل شده باشد، تعیین دقیق الگوی بیان ژن هدف ممکن است دشوار باشد. اگر یک نمونه ناهمگن باشد، از یکی از روش‌های متعددی که برای جداسازی انواع سلول‌های خاص موجود است، استفاده می‌گردد، به‌عنوان‌مثال، برش بافت (tissue dissection)، بیوپسی سوزنی (needle biopsies)، و میکرودیسکشن با لیزر (laser capture microdissection). سپس می‌توان از سلول‌های جمع‌آوری‌شده برای به‌دست‌آوردن نمونه‌های RNA استفاده کرد.

استخراج RNA (RNA Extraction) در آر تی پی سی آر

RNA کل یا پلی (A+) را می‌توان برای اکثر کاربردهای ریل تایم RT-qPCR استفاده کرد. یکی از نکات مهم در کار با RNA حذف RNase‌ها در محلول‌ها، مواد مصرفی و ظروف آزمایشگاهی است. محلول‌های آماده بدون RNase را می‌توان خریداری کرد یا محلول‌ها را می‌توان با دی اتیل پیروکربنات (DEPC) تیمار و سپس اتوکلاو کرد. RNaseها روی ظروف آزمایشگاهی نیز می‌توانند با تیمار DEPC یا با حرارت دیدن در دمای 250 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت، غیرفعال شوند.

نمونه‌های RNA آماده شده ممکن است، برای جلوگیری از تقویت احتمالی با آلودگی DNA ژنومی که می‌تواند منجر به تخمین بیش از حد تعداد کپی mRNA شود، نیاز به تیمار با DNase داشته باشد. بااین‌حال، هنگامی که مواد اولیه محدود است، تیمار با DNase ممکن است توصیه نشود، زیرا دست‌کاری اضافی می‌تواند منجر به ازدست‌دادن RNA شود. از تقویت آلودگی DNA ژنومی می‌توان با طراحی پرایمرهای اختصاصی رونوشت جلوگیری کرد، به‌عنوان‌مثال، پرایمرهایی که در سراسر اتصالات اسپلایس (splice junctions) گسترش یا تقویت می‌شوند.

بیشتر بخوانید: دی ان ای (DNA) چیست؟ – به زبان ساده

تجزیه‌وتحلیل کمیت و کیفیت اسیدنوکلئیک

کمی‌سازی دقیق اسیدنوکلئیک برای تجزیه‌وتحلیل بیان ژن ضروری است، به‌ویژه زمانی که مقادیر RNA کل برای نرمالایز کردن بیان ژن هدف استفاده می‌شود. غلظت و خلوص RNA معمولاً با اندازه‌گیری نسبت جذب UV در 260 نانومتر و 280 نانومتر تعیین می‌شود.

ابزار مناسب تکنیک  Real-Time PCR

یک سیستم تشخیص آر تی پی سی آر (Real-time PCR) شامل یک سیکلر حرارتی مجهز به یک ماژول تشخیص نوری برای اندازه‌گیری سیگنال فلورسانس تولید شده در طول هر چرخه تقویت به‌عنوان فلوروفور متصل به‌توالی هدف است. سیستم‌های تشخیص ریل تایم PCR  Bio-Rad دارای چرخه‌های حرارتی با ماژول‌های قابل‌تعویض برای تشخیص تک پلکس و مولتی پلکس فلوروفورها و همچنین واحدهای آر تی پی سی آر (Real-time PCR)  ثابت هستند. همه سیستم‌های qPCR دارای عملکرد گرادیان حرارتی هستند.

جمع‌بندی

همان‌طور که اشاره شد، PCR روشی برای کمی‌سازی اسیدهای نوکلئیک و اندازه‌گیری بیان ژن است. در آر تی پی سی آر (Real-time PCR)، انباشت محصول تقویت با پیشرفت واکنش، در زمان واقعی، با کمی‌سازی محصول پس از هر چرخه اندازه‌گیری می‌شود. امروزه در دنیای علوم زیستی، ریل تایم پی سی آر کاربردهای بسیاری از جمله در زمینه‌های آنالیز بیان ژن و فنوتیپ‌سازی سرطان دارد.